厌氧菌是自然界中分布广泛、性能独特的一类微生物, 专性厌氧菌因其细胞内缺乏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶或过氧化物酶,因此无法消除机体在有氧条件下产生的有毒产物——超氧阴离子自由基，故这类微生物极易受氧毒害。专性厌氧微生物即使短暂地把它暴露于空气中,也会引起损伤致死。因此对它们进行分离、培养和研究时,就必须有一套相应的培养分离方法。 目的要求
1、了解厌氧菌培养常用方法：疱肉培养法、焦性没食子酸法、厌氧罐法、厌氧箱法、厌氧培养袋法等。
2、掌握结核杆菌的形态特点，熟悉结核杆菌的培养特性。 3、掌握抗酸染色的原理及操作过程。
4、了解结核杆菌标本的采集、培养前处理及制片。 材料
疱肉培养基、厌氧罐、厌氧箱、厌氧培养袋、焦性没食子酸、NaOH、脱脂棉等 内容与方法
厌氧菌培养方法：包括物理、化学和生物学方法（总之为厌氧菌培养形成一种无氧环境） 1. 厌氧罐法：
厌氧产气袋加入水后会产生氢气和二氧化碳，氢气在厌氧催化剂（冷触酶钯粒钯粒由粉红色变成浅兰色而失效，160℃2h，即可恢复其活力而重复使用）的作用下，与氧结合生成水，可在30分钟内将氧含量降**1%以下。二氧化碳可以促进厌氧菌的生长。罐内放有煮沸去氧的美兰指示剂一管。 [每次要新鲜配制，在试管内将亚甲蓝(0.5%亚甲蓝3 ml加水**100 ml)、6%葡萄糖和氢氧化钠(1/10 mol/L NaOH 6 ml加水**100 ml)3种溶液等量混合并煮沸还原**无色，立即将指示剂管放入预先装好培养物的罐内 。如果能在孵育的整个过程中维持厌氧条件，则指示剂溶液将无色，否则指示剂则变色。亚甲蓝有氧为蓝色，无氧为无色。] 亚甲蓝作为一种氧化还原指示剂。 2.焦性没食子酸法：
焦性没食子酸+NaOH→焦性没食子橙（黑、褐色）[吸收游离的氧气]。 培养皿法用培养皿盖，铺上一薄层灭菌脱脂棉，将1g焦性没食子酸放于其上。用肉膏蛋白陈琼脂培养基倒平板，待凝固稍干燥后，在平板上一半划线接种巴氏芽孢梭菌，下一半划线接种荧光假单胞菌，并在皿底用记号笔作好标记。滴加10％NaOH溶液约0.5ml于焦性没食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即将已接种的平板覆盖于玻璃板上或培养皿盖上，必须将脱脂棉全部罩住，焦性没食子酸反应物切勿与培养基表面接触，以溶化的石蜡 密封皿底与玻璃板或皿盖的接触处。置37℃温箱培养24～48h。 3.
厌氧培养箱法：
由厌氧环境操作箱、恒温培养箱、高度真空传递箱等组成，能任意输入所需气体，准确调节流量，以满足厌氧菌生长需要。
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原理
分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。 材料
酒精灯、玻片、结核病人痰液、石碳酸复红、盐酸酒精、碱性美兰等 步骤
1.取开放性肺结核病人的痰液涂片，自然干燥后，通过火焰固定。 2.初染：痰膜上加一小的方形吸水纸，在吸水纸上滴加石炭酸复红染液，在火焰高处徐徐加温**冒蒸气，并维持 5 分钟（注意切勿让染液沸腾或煮干），当染液蒸发减少时，需再加染液补充。待标本片冷却后水洗。
3.用 3% 盐酸酒精脱色，**无红色染液流下为止（反复2～3次，一般需要1～2min）水洗。
4.复染：用碱性美蓝复染 1 分钟，水洗，吸干，镜检。抗酸杆菌呈红色，背景及非抗酸菌呈蓝色。
